Содержание
Электрофорез в полиакриламидном геле, или ПААГ, представляет собой метод, используемый для разделения органических молекул в биологическом образце. Молекулы меньшего размера и веса быстрее мигрируют в полиакриламидный гель при подаче электрического тока. Острые отчетливые полосы обычно наблюдаются после инкубации готового геля в месте. Это относительно простой метод. Однако отсутствие полос, размытых или нечетких полос может указывать на проблему на одном или нескольких этапах способа. Вы должны следовать основным рекомендациям, чтобы решить проблемы метода гель-электрофореза, при которых результаты не соответствуют ожидаемым.
направления
-
Начните с последнего этапа гель-электрофореза и работайте задним числом. Для гель-электрофореза заключительным этапом является процедура окрашивания, используемая для наблюдения полос образцов. В процессе окрашивания должно возникать немного проблем. Тем не менее, краситель должен быть хорошо растворен в соответствующем буфере, прежде чем он будет использован для окрашивания геля. Убедитесь, что была использована правильная концентрация красителя.
-
Проверьте источник питания. Отсутствие полос может указывать на то, что конфигурация тока или напряжения слишком высока, и испытательные образцы мигрируют из геля. Высокие настройки также могут вызвать слишком быстрое перемещение компонентов образца через гель, что приводит к плохому разрешению и нечетким полосам. Образцы могут не мигрировать через гель, если конфигурация источника питания низкая. Образцы также могут накапливаться в лунке, где они были загружены, и не мигрировать через гель.
-
Проверьте жидкий акриламид, используемый для превращения полиакриламидного геля. Как правило, процентное содержание акриламида, используемого для превращения полиакриламидного геля, составляет от 5% до 15%. Образцы, состоящие из более крупных молекул, загружаются в 5% гель, потому что большие фрагменты движутся в геле медленнее с более высоким процентом акриламида. Маленькие молекулы загружаются в гель с более высоким процентным содержанием, потому что низкая концентрация геля не сможет обрабатывать меньшие образцы.
-
Проверьте реагенты, используемые для полимеризации акриламида. Полиакриламидный гель образуется путем полимеризации жидкой смеси, состоящей из бис-акриламида и акриламида. Персульфат аммония и ТЕМЕД добавляют к акриламиду для катализа образования геля. Как правило, акриламид должен демонстрировать признаки полимеризации (образование геля) через 15 минут после добавления персульфата аммония и ТЕМЕД. Полимеризация, которая происходит очень быстро, является результатом большого количества персульфата аммония. Если этого недостаточно, это может привести к неполной или неравномерной полимеризации.
-
Подтвердите количество загруженных образцов. Высокие концентрации образца могут медленно проходить через гель и снижать разрешение полосы. Низкая концентрация образца может не наблюдаться после окрашивания геля. Эти красители накладывают ограничения на минимальное количество образца, которое можно визуализировать в результате цветовой чувствительности.
-
Подтвердите качество загруженных образцов. Соли и другие загрязнители, присутствующие в образце, могут влиять на движение образца вдоль геля. Электрофорез является результатом пропускания электрического тока через гель, содержащий проводящий буфер тока; высокая концентрация солей в образце может повлиять на движение этого тока через гель. При выделении образца следует использовать набор для очистки, чтобы получить относительно чистый образец.
-
Просмотрите литературу или письменный протокол, чтобы определить, использовался ли правильный «PAGE» для проведения эксперимента. Процентное содержание акриламида в «PAGE» зависит от размера исследуемого образца. Литература может также предоставить конкретную информацию относительно установления источника энергии и скорости миграции образца.
чаевые
- Представленные рекомендации являются общими для приложений в биологических исследованиях.
- При решении любой лабораторной процедуры лучше всего начать с последнего шага и работать задним числом, чтобы определить проблему.
предупреждение
- При работе с акриламидом и полиакриламидом надевайте перчатки. Акриламид является нейротоксическим реагентом и может всасываться через кожу. Полиакриламид не является нейротоксичным, однако он часто содержит неполимеризованный акриламид и все еще может считаться токсичным.
Что вам нужно
- Класс качества бис: акриламидные пластины или предварительно сформированные пластины
- Две стеклянные тарелки
- Бис-акриламид
- TBE буфер (Трис, борная кислота, ЭДТА)
- Блок питания
- Верхняя крышка камеры
- Нижняя крышка камеры
- Образец ДНК белка
- TEMED
- Персульфат аммония
- Гель для окрашивания