Содержание
Лиза - это греческое слово, которое означает просто «разделять» или «разлагать». Это хорошее описание реакции, которая происходит с клетками в буфере для лизиса, растворе, который разрушает их для извлечения их содержимого. Ученые используют эти растворы для извлечения ДНК или белков при анализе клеток, особенно в случае бактерий. Тип буфера для лизиса клеток варьируется в зависимости от типа эксперимента, однако мы упомянем некоторые общие варианты.
Буфер и соль
Буферные растворы стабилизируют pH, в то время как клетки подвергаются процессу лизиса. Раствор трис-HCL является наиболее распространенным буфером для буферизации при pH 8, если pH желателен. HEPES - еще один распространенный буферный раствор в этих экспериментах. Хлорид натрия также может быть добавлен для увеличения ионной силы, общей концентрации растворенных веществ вне клеток. Последнее важно, поскольку вода может распространяться на все клеточные мембраны, от областей с низкой концентрацией растворенных веществ до областей с высокой концентрацией.
Моющее средство
Моющее средство является основным ингредиентом, растворяющим клеточную мембрану, так что содержимое может вытечь. Моющие средства представляют собой амфипатические молекулы, то есть с одним концом, который легко взаимодействует с молекулами воды, в то время как другой гидрофобный конец, или «который боится воды», не взаимодействует. Они могут растворять жиры, образуя мицеллы, небольшие группы, в которых гидрофобные хвосты молекул детергента указывают внутрь к молекулам жира. Обычными детергентами являются додецилсульфат натрия или SDS, NP-40 и tritonX.
Хелатирующие агенты и ингибиторы
Буферы для лизиса обычно также содержат хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) или ретиленгликольтетрауксусная кислота (EGTA). Эти химические вещества связываются с ионами металлов с зарядом +2 (например, с магнием и кальцием), что делает их недоступными для других реакций. Многие ДНКазы (белки, которые пережевывают ДНК) и протеазы (белки, которые разрезают другие белки) нуждаются в ионах магния для работы, поэтому, лишая их этого основного ингредиента, ЭДТА и ЭГТА, они помогают снизить уровень протеазы или активности ДНКазы. Однако они не исключают их полностью, а некоторые протеазы не зависят от кофакторов магния, поэтому лизисные буферы иногда также содержат вещества, называемые ингибиторами протеаз, которые связываются с ним и мешают ему работать должным образом.
Щелочной лизис
Щелочной лизис - очень распространенный метод очистки плазмид от бактерий. Этот метод подразумевает использование трех решений. Первый содержит глюкозу, буфер трис-HCL, ЭДТА и РНКазы. Глюкоза создает высокую концентрацию растворенных веществ вне бактерий, поэтому они становятся слегка дряблыми, облегчая процесс лизиса. EDTA и трис-HCL работают, как описано ранее, в то время как РНКаза пережевывает любую РНК внутри клетки, чтобы убрать ее с пути. Второй раствор эффективно лизис клеток. Он содержит детергент SDS и NaOH, который повышает pH до 12 или выше, денатурируя белки внутри клетки и заставляя ДНК разделяться на простые нити. Третий раствор содержит ацетат калия для восстановления pH до более нейтрального уровня, так что нити плазмидной ДНК могут соединяться. Тем временем денатурированные белки объединяются и выпадают в осадок, в то время как ионы додецилсульфата соединяются с ионами калия с образованием нерастворимого соединения, которое также может выпадать в осадок из раствора.